ຜະລິດຕະພັນ
ຊຸດກວດຫາ Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR ສຳລັບ 2019-nCoV
ການນໍາໃຊ້ທີ່ຄາດວ່າຈະ
ຊຸດນີ້ແມ່ນໃຊ້ສໍາລັບການກວດພົບຄຸນນະພາບຂອງໂຣກ coronavirus ໃຫມ່ (2019-nCoV) ໂດຍໃຊ້ຮູຄໍ, swabs nasopharyngeal, bronchoalveolar lavage fluid, sputum. ຜົນການກວດພົບຂອງຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນສໍາລັບການອ້າງອິງທາງດ້ານຄລີນິກເທົ່ານັ້ນ, ແລະມັນບໍ່ຄວນຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຫຼັກຖານດຽວສໍາລັບການວິເຄາະທາງດ້ານຄລີນິກຂອງການປິ່ນປົວແລະການປິ່ນປົວທີ່ແນະນໍາ. ການສະແດງທາງດ້ານຄລີນິກ ແລະການກວດຫ້ອງທົດລອງອື່ນໆ.
ຫຼັກການກວດກາ
ຊຸດດັ່ງກ່າວແມ່ນອີງໃສ່ເທກໂນໂລຍີ RT-PCR ຂັ້ນຕອນດຽວ. ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ເຊື້ອໂຣກ coronavirus ໃໝ່ 2019 (2019-nCoV) ORF1ab ແລະ N ຖືກເລືອກເປັນເຂດເປົ້າຫມາຍການຂະຫຍາຍ. primers ສະເພາະ ແລະ fluorescent probes (N gene probes ແມ່ນຕິດສະຫຼາກກັບ FAM ແລະ ORF1ab probes ມີປ້າຍ HEX) ຖືກອອກແບບມາເພື່ອກວດຫາໂຣກ coronavirus RNA ຊະນິດໃຫມ່ 2019 ໃນຕົວຢ່າງ. ຊຸດດັ່ງກ່າວຍັງປະກອບມີລະບົບການກວດສອບການຄວບຄຸມພາຍໃນ endogenous (ການສືບສວນ gene ຄວບຄຸມພາຍໃນທີ່ມີປ້າຍ CY5) ເພື່ອຕິດຕາມຂະບວນການເກັບກໍາຕົວຢ່າງ, RNA ແລະ PCR amplification, ດັ່ງນັ້ນການຫຼຸດຜ່ອນຜົນໄດ້ຮັບທາງລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ອົງປະກອບຕົ້ນຕໍ
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ(48T/ຊຸດ) |
| ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| ການຄວບຄຸມທາງລົບ | 1500µl |
| nCOV ການຄວບຄຸມທາງບວກ (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
reagents ຂອງຕົນເອງ: ການສະກັດເອົາ RNA ຫຼື reagents purification. ການຄວບຄຸມທາງລົບ/ທາງບວກ: ການຄວບຄຸມທາງບວກແມ່ນ RNA ທີ່ບັນຈຸຊິ້ນສ່ວນເປົ້າໝາຍ, ໃນຂະນະທີ່ການຄວບຄຸມທາງລົບແມ່ນນ້ຳທີ່ບໍ່ມີອາຊິດນິວຄລີອິກ. ໃນລະຫວ່າງການນໍາໃຊ້, ພວກເຂົາຄວນຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການສະກັດເອົາແລະຄວນໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາການຕິດເຊື້ອ. ຄວນໄດ້ຮັບການຄຸ້ມຄອງ ແລະ ທຳລາຍລ້າງຕາມລະບຽບການທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.
gene ອ້າງອີງພາຍໃນແມ່ນ gene RnaseP ຂອງມະນຸດ.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາແລະວັນຫມົດອາຍຸ
-20 ± 5 ℃, ຫຼີກເວັ້ນການຊ້ໍາ freezing ແລະ thawing ຫຼາຍກ່ວາ 5 ເທື່ອ, ໃຊ້ໄດ້ສໍາລັບການ 6 ເດືອນ.
ເຄື່ອງມືທີ່ໃຊ້ໄດ້
ດ້ວຍ FAM / HEX / CY5 ແລະອຸປະກອນ PCR fluorescent ຫຼາຍຊ່ອງອື່ນໆ.
ຄວາມຕ້ອງການຕົວຢ່າງ
1. ປະເພດຕົວຢ່າງທີ່ໃຊ້ໄດ້: ທໍ່ຮູຄໍ, ທໍ່ກະເພາະປັດສະວະ, ນ້ຳລ້າງຫຼອດລົມ, ຂີ້ກະເທີ່.
2. ການເກັບຕົວຢ່າງ (ເຕັກນິກ aseptic)
pharyngeal swab: ເຊັດຕ່ອມທອນຊີນແລະຝາຫລັງ pharyngeal ດ້ວຍສອງ swab ໃນເວລາດຽວກັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເອົາຫົວ swab ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ທົດລອງທີ່ມີສານສະກັດຈາກຕົວຢ່າງ.
ຂີ້ກະເທີ່: ຫຼັງຈາກຄົນເຈັບມີອາການໄອເລິກແລ້ວ, ໃຫ້ເກັບຂີ້ກະເທີ່ທີ່ມີອາການໄອໃສ່ໃນທໍ່ທົດສອບຝາອັດສະກູທີ່ບັນຈຸນ້ຳສະຫຼັດ; ນ້ໍາ lavage bronchoalveolar: ການເກັບຕົວຢ່າງໂດຍຜູ້ຊ່ຽວຊານທາງການແພດ. 3.ການເກັບຮັກສາແລະການຂົນສົ່ງຕົວຢ່າງ
ຕົວຢ່າງສໍາລັບການແຍກເຊື້ອໄວຣັສແລະການທົດສອບ RNA ຄວນໄດ້ຮັບການທົດສອບໄວເທົ່າທີ່ຈະໄວໄດ້. ຕົວຢ່າງທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 24 ຊົ່ວໂມງສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 4 ℃; ທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 24
ຊົ່ວໂມງຄວນຈະໄດ້ຮັບການເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -70 ℃ຫຼືຂ້າງລຸ່ມນີ້ (ຖ້າຫາກວ່າບໍ່ມີສະພາບການເກັບຮັກສາ -70 ℃, ພວກເຂົາເຈົ້າຄວນຈະເປັນ.
ເກັບຮັກສາໄວ້ຊົ່ວຄາວຢູ່ທີ່ -20 ℃ຕູ້ເຢັນ). ຕົວຢ່າງຄວນຫຼີກລ່ຽງການແຊ່ແຂງ ແລະ ແຊ່ແຂງຊ້ຳໆໃນລະຫວ່າງການຂົນສົ່ງ. ຕົວຢ່າງຄວນຖືກສົ່ງໄປຫ້ອງທົດລອງໄວເທົ່າທີ່ຈະໄວໄດ້ຫຼັງຈາກການເກັບລວບລວມ. ຖ້າຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ຮັບການຂົນສົ່ງໃນໄລຍະໄກ, ການເກັບຮັກສານ້ໍາກ້ອນແຫ້ງແມ່ນແນະນໍາ.
ວິທີການທົດສອບ
1 ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງແລະການສະກັດເອົາ RNA (ພື້ນທີ່ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງ)
ແນະນໍາໃຫ້ເອົາຕົວຢ່າງຂອງແຫຼວ 200μl ສໍາລັບການສະກັດເອົາ RNA. ສໍາລັບຂັ້ນຕອນການສະກັດເອົາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ, ເບິ່ງຄໍາແນະນໍາຂອງຊຸດສະກັດ RNA ການຄ້າ. ທັງທາງລົບ ແລະທາງລົບ
ການຄວບຄຸມໃນຊຸດນີ້ໄດ້ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການສະກັດເອົາ.
2 ການກະກຽມ reagent PCR (ພື້ນທີ່ກະກຽມ reagent)
2.1 ເອົາອົງປະກອບທັງຫມົດອອກຈາກຊຸດແລະ thaw ແລະປະສົມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. Centrifuge ຢູ່ 8,000 rpm ສໍາລັບສອງສາມວິນາທີກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້; ຄິດໄລ່ຈໍານວນທີ່ຕ້ອງການຂອງ reagents, ແລະລະບົບຕິກິຣິຍາແມ່ນໄດ້ກະກຽມດັ່ງທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນຕາຕະລາງຕໍ່ໄປນີ້:
| ອົງປະກອບ | N serving (ລະບົບ 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × ນ |
| ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ RT-PCR | 2 µl × ນ |
| *N = ຈໍານວນຕົວຢ່າງທີ່ທົດສອບ + 1 (ການຄວບຄຸມທາງລົບ) + 1 (nCOVການຄວບຄຸມທາງບວກ) | |
2.2 ຫຼັງຈາກປະສົມອົງປະກອບຢ່າງລະອຽດ, centrifuge ເປັນເວລາສັ້ນໆເພື່ອໃຫ້ຂອງແຫຼວທັງຫມົດທີ່ຢູ່ໃນຝາທໍ່ຕົກລົງໄປລຸ່ມຂອງທໍ່, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ aliquot ລະບົບການຂະຫຍາຍ 20 µl ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ PCR.
3 ການເກັບຕົວຢ່າງ (ພື້ນທີ່ກະກຽມຕົວຢ່າງ)
ຕື່ມ 5μl ຂອງການຄວບຄຸມທາງລົບແລະໃນທາງບວກຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ. RNA ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ຈະທົດສອບແມ່ນເພີ່ມໃສ່ທໍ່ປະຕິກິລິຍາ PCR.
ບີບທໍ່ໃຫ້ແຫນ້ນ ແລະ centrifuge ຢູ່ 8,000 rpm ສໍາລັບສອງສາມວິນາທີກ່ອນທີ່ຈະໂອນມັນໄປຫາພື້ນທີ່ກວດຫາການຂະຫຍາຍ.
4 ການຂະຫຍາຍ PCR (ພື້ນທີ່ກວດຫາການຂະຫຍາຍ)
4.1 ວາງທໍ່ປະຕິກິລິຍາຢູ່ໃນຫ້ອງຕົວຢ່າງຂອງເຄື່ອງມື, ແລະກໍານົດພາລາມິເຕີດັ່ງນີ້:
| ເວທີ | ຮອບວຽນ ເລກ | ອຸນຫະພູມ(°C) | ເວລາ | ການເກັບກໍາເວັບໄຊ |
| ປີ້ນກັບກັນການຖອດຂໍ້ຄວາມ | 1 | 42 | 10 ນາທີ | - |
| ກ່ອນ denaturationn | 1 | 95 | 1 ນທ | - |
| ຮອບວຽນ | 45 | 95 | 15ວິ | - |
| 60 | 30s | ການເກັບກໍາຂໍ້ມູນ |
ການເລືອກຊ່ອງທາງການຊອກຄົ້ນຫາເຄື່ອງມື: ເລືອກຊ່ອງ FAM, HEX, CY5 ສໍາລັບສັນຍານ fluorescence. ສໍາລັບການອ້າງອີງ fluorescent NONE, ກະລຸນາຢ່າເລືອກ ROX.
5 ການວິເຄາະຜົນໄດ້ຮັບ (ກະລຸນາເບິ່ງຄໍາແນະນໍາການທົດລອງຂອງແຕ່ລະເຄື່ອງມືສໍາລັບການຕັ້ງ)
ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາ, ບັນທຶກຜົນໄດ້ຮັບ. ຫຼັງຈາກການວິເຄາະ, ປັບຄ່າເລີ່ມຕົ້ນ, ມູນຄ່າສິ້ນສຸດ, ແລະຄ່າເລີ່ມຕົ້ນຂອງເສັ້ນພື້ນຖານຕາມຮູບພາບ (ຜູ້ໃຊ້ສາມາດປັບຕົວຕາມສະຖານະການຕົວຈິງ, ມູນຄ່າເລີ່ມຕົ້ນສາມາດຕັ້ງຄ່າໄດ້ 3 ~ 15, ຄ່າສິ້ນສຸດສາມາດຕັ້ງຄ່າໄດ້ 5 ~ 20, ປັບ) ໃນກາຟ logarithmic ຢູ່ໃນຂອບເຂດຂອງປ່ອງຢ້ຽມ, ເສັ້ນຂີດເສັ້ນໂຄ້ງຢູ່ໃນເສັ້ນໂຄ້ງຂອງເສັ້ນໂຄ້ງຫຼືເສັ້ນໂຄ້ງຂ້າງລຸ່ມນີ້. ເສັ້ນຂອບເຂດ).
6 ການຄວບຄຸມ Quauty (ການຄວບຄຸມຂັ້ນຕອນແມ່ນລວມຢູ່ໃນການທົດສອບ) ການຄວບຄຸມທາງລົບ: ບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນສໍາລັບຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM, HEX, CY5
COV ການຄວບຄຸມໃນທາງບວກ: ເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນຂອງຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM ແລະ HEX, Ct value≤32, ແຕ່ບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຂອງຊ່ອງ CY5;
ຄວາມຕ້ອງການຂ້າງເທິງນີ້ຕ້ອງໄດ້ຮັບການຕອບສະຫນອງພ້ອມໆກັນໃນການທົດລອງດຽວກັນ; ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ, ການທົດລອງບໍ່ຖືກຕ້ອງແລະຈໍາເປັນຕ້ອງເຮັດຊ້ໍາອີກ.
7 ການກໍານົດຜົນໄດ້ຮັບ.
7.1 ຖ້າບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນຫຼືຄ່າ Ct> 40 ໃນຊ່ອງ FAM ແລະ HEX ຂອງຕົວຢ່າງການທົດສອບ, ແລະມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຢູ່ໃນຊ່ອງ CY5, ມັນສາມາດຕັດສິນໄດ້ວ່າບໍ່ມີ 2019 ໃຫມ່ coronavirus (2019-nCoV) RNA ໃນຕົວຢ່າງ;
.2 ຖ້າຕົວຢ່າງການທົດສອບມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນຢູ່ໃນຊ່ອງ FAM ແລະ HEX, ແລະຄ່າ Ct ແມ່ນ ≤40, ມັນສາມາດຕັດສິນໄດ້ວ່າຕົວຢ່າງແມ່ນເປັນບວກສໍາລັບ 2019 ໂຣກ coronavirus ໃຫມ່ (2019-nCoV).
7.3 ຖ້າຕົວຢ່າງການທົດສອບມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນພຽງແຕ່ຢູ່ໃນຊ່ອງທາງຫນຶ່ງຂອງ FAM ຫຼື HEX, ແລະຄ່າ Ct ແມ່ນ ≤40, ແລະບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍຢູ່ໃນຊ່ອງທາງອື່ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບໃຫມ່. ຖ້າຜົນໄດ້ຮັບຂອງການທົດສອບຄືນໃຫມ່ແມ່ນສອດຄ່ອງ, ຕົວຢ່າງສາມາດຖືກຕັດສິນວ່າເປັນບວກສໍາລັບໃຫມ່
ໂຄໂຣນາໄວຣັສ 2019 (2019-nCoV). ຖ້າຜົນກວດຄືນແມ່ນເປັນລົບ, ມັນສາມາດຖືກຕັດສິນໄດ້ວ່າຕົວຢ່າງແມ່ນເປັນລົບຕໍ່ໂຣກ coronavirus ໃໝ່ 2019 (2019-nCoV).
ມູນຄ່າການຕັດສິນໃນທາງບວກ
ວິທີການເສັ້ນໂຄ້ງ ROC ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຄ່າ CT ອ້າງອິງຂອງຊຸດແລະມູນຄ່າການອ້າງອີງການຄວບຄຸມພາຍໃນແມ່ນ 40.
ການຕີລາຄາຜົນການທົດສອບ
1.ແຕ່ລະການທົດລອງຄວນຈະໄດ້ຮັບການທົດສອບສໍາລັບການຄວບຄຸມທາງລົບແລະໃນທາງບວກ. ຜົນການທົດສອບສາມາດຖືກກໍານົດພຽງແຕ່ເມື່ອການຄວບຄຸມຕອບສະຫນອງຄວາມຕ້ອງການການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
2. ເມື່ອຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM ແລະ HEX ເປັນບວກ, ຜົນໄດ້ຮັບຈາກຊ່ອງທາງ CY5 (ຊ່ອງທາງການຄວບຄຸມພາຍໃນ) ອາດຈະເປັນທາງລົບຍ້ອນການແຂ່ງຂັນຂອງລະບົບ.
3. ເມື່ອຜົນຂອງການຄວບຄຸມພາຍໃນແມ່ນເປັນລົບ, ຖ້າຊ່ອງທາງການກວດຫາ FAM ແລະ HEX ຂອງທໍ່ທົດສອບແມ່ນເປັນລົບ, , ມັນຫມາຍຄວາມວ່າລະບົບຖືກປິດໃຊ້ງານຫຼືການເຮັດວຽກຜິດພາດ, t ການທົດສອບບໍ່ຖືກຕ້ອງ. ດັ່ງນັ້ນ, ຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບໃຫມ່.
