ຜະລິດຕະພັນ
ຊຸດກວດຫາ Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR ສຳລັບ 2019-nCoV
ການນໍາໃຊ້ທີ່ຄາດວ່າຈະ
ຊຸດນີ້ຖືກໃຊ້ເພື່ອກວດຫາຄຸນນະພາບຂອງໄວຣັສໂຄໂຣນາສາຍພັນໃໝ່ (2019-nCoV) ໂດຍໃຊ້ຜ້າພັນຄໍ, ຝາອັດປາກມົດລູກ, ນໍ້າເສຍໃນຫຼອດລົມ, ຂີ້ກະເທີ່. ຜົນການກວດພົບຂອງຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນເພື່ອອ້າງອີງທາງຄລີນິກເທົ່ານັ້ນ, ແລະບໍ່ຄວນໃຊ້ເປັນພຽງຢ່າງດຽວ. ຫຼັກຖານສໍາລັບການວິນິດໄສທາງຄລີນິກແລະການປິ່ນປົວ. ການວິເຄາະທີ່ສົມບູນແບບຂອງສະພາບແມ່ນແນະນໍາໃຫ້ປະສົມປະສານກັບອາການທາງດ້ານຄລີນິກຂອງຄົນເຈັບແລະການທົດສອບຫ້ອງທົດລອງອື່ນໆ.
ຫຼັກການກວດກາ
ຊຸດດັ່ງກ່າວແມ່ນອີງໃສ່ເທກໂນໂລຍີ RT-PCR ຂັ້ນຕອນດຽວ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ເຊື້ອໂຣກ coronavirus ໃໝ່ 2019 (2019-nCoV) ORF1ab ແລະ N ຖືກເລືອກເປັນເຂດເປົ້າຫມາຍການຂະຫຍາຍ.primers ສະເພາະ ແລະ fluorescent probes (N gene probes ແມ່ນຕິດສະຫຼາກກັບ FAM ແລະ ORF1ab probes ມີປ້າຍ HEX) ຖືກອອກແບບມາເພື່ອກວດຫາໂຣກ coronavirus RNA ຊະນິດໃຫມ່ 2019 ໃນຕົວຢ່າງ.ຊຸດດັ່ງກ່າວຍັງປະກອບມີລະບົບການກວດສອບການຄວບຄຸມພາຍໃນ endogenous (ການສືບສວນ gene ຄວບຄຸມພາຍໃນທີ່ມີປ້າຍ CY5) ເພື່ອຕິດຕາມຂະບວນການເກັບກໍາຕົວຢ່າງ, RNA ແລະ PCR amplification, ດັ່ງນັ້ນການຫຼຸດຜ່ອນຜົນໄດ້ຮັບທາງລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ອົງປະກອບຕົ້ນຕໍ
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ(48T/ຊຸດ) |
| ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| ການຄວບຄຸມທາງລົບ | 1500µl |
| nCOV ການຄວບຄຸມທາງບວກ (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
reagents ຂອງຕົນເອງ: ການສະກັດເອົາ RNA ຫຼື reagents purification.ການຄວບຄຸມທາງລົບ/ທາງບວກ: ການຄວບຄຸມທາງບວກແມ່ນ RNA ທີ່ບັນຈຸຊິ້ນສ່ວນເປົ້າໝາຍ, ໃນຂະນະທີ່ການຄວບຄຸມທາງລົບແມ່ນນ້ຳທີ່ບໍ່ມີອາຊິດນິວຄລີອິກ.ໃນລະຫວ່າງການນໍາໃຊ້, ພວກເຂົາຄວນຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການສະກັດເອົາແລະຄວນໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາການຕິດເຊື້ອ.ຄວນໄດ້ຮັບການຄຸ້ມຄອງ ແລະ ທຳລາຍລ້າງຕາມລະບຽບການທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.
gene ອ້າງອີງພາຍໃນແມ່ນ gene RnaseP ຂອງມະນຸດ.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາແລະວັນຫມົດອາຍຸ
-20 ± 5 ℃, ຫຼີກເວັ້ນການຊ້ໍາ freezing ແລະ thawing ຫຼາຍກ່ວາ 5 ເທື່ອ, ໃຊ້ໄດ້ສໍາລັບການ 6 ເດືອນ.
ເຄື່ອງມືທີ່ໃຊ້ໄດ້
ດ້ວຍ FAM / HEX / CY5 ແລະອຸປະກອນ PCR fluorescent ຫຼາຍຊ່ອງອື່ນໆ.
ຄວາມຕ້ອງການຕົວຢ່າງ
1. ປະເພດຕົວຢ່າງທີ່ໃຊ້ໄດ້: ທໍ່ຮູຄໍ, ທໍ່ກະເພາະປັດສະວະ, ນ້ຳລ້າງຫຼອດລົມ, ຂີ້ກະເທີ່.
2. ການເກັບຕົວຢ່າງ (ເຕັກນິກ aseptic)
pharyngeal swab: ເຊັດຕ່ອມທອນຊີນແລະຝາຫລັງ pharyngeal ດ້ວຍສອງ swab ໃນເວລາດຽວກັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເອົາຫົວ swab ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ທົດລອງທີ່ມີສານສະກັດຈາກຕົວຢ່າງ.
ຂີ້ກະເທີ່: ຫຼັງຈາກຄົນເຈັບມີອາການໄອເລິກແລ້ວ, ໃຫ້ເກັບຂີ້ກະເທີ່ທີ່ມີອາການໄອໃສ່ໃນທໍ່ທົດສອບຝາອັດສະກູທີ່ບັນຈຸນ້ຳສະຫຼັດ;ນ້ໍາ lavage bronchoalveolar: ການເກັບຕົວຢ່າງໂດຍຜູ້ຊ່ຽວຊານທາງການແພດ.3.ການເກັບຮັກສາແລະການຂົນສົ່ງຕົວຢ່າງ
ຕົວຢ່າງສໍາລັບການແຍກເຊື້ອໄວຣັສແລະການທົດສອບ RNA ຄວນໄດ້ຮັບການທົດສອບໄວເທົ່າທີ່ຈະໄວໄດ້.ຕົວຢ່າງທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 24 ຊົ່ວໂມງສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 4 ℃;ທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 24
ຊົ່ວໂມງຄວນຈະໄດ້ຮັບການເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -70 ℃ຫຼືຂ້າງລຸ່ມນີ້ (ຖ້າຫາກວ່າບໍ່ມີສະພາບການເກັບຮັກສາ -70 ℃, ພວກເຂົາເຈົ້າຄວນຈະເປັນ.
ເກັບຮັກສາໄວ້ຊົ່ວຄາວຢູ່ທີ່ -20 ℃ຕູ້ເຢັນ).ຕົວຢ່າງຄວນຫຼີກລ່ຽງການແຊ່ແຂງ ແລະ ແຊ່ແຂງຊ້ຳໆໃນລະຫວ່າງການຂົນສົ່ງ.ຕົວຢ່າງຄວນຖືກສົ່ງໄປຫ້ອງທົດລອງໄວເທົ່າທີ່ຈະໄວໄດ້ຫຼັງຈາກການເກັບລວບລວມ.ຖ້າຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ຮັບການຂົນສົ່ງໃນໄລຍະໄກ, ການເກັບຮັກສານ້ໍາກ້ອນແຫ້ງແມ່ນແນະນໍາ.
ວິທີການທົດສອບ
1 ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງແລະການສະກັດເອົາ RNA (ພື້ນທີ່ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງ)
ແນະນໍາໃຫ້ເອົາຕົວຢ່າງຂອງແຫຼວ 200μl ສໍາລັບການສະກັດເອົາ RNA.ສໍາລັບຂັ້ນຕອນການສະກັດເອົາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ, ເບິ່ງຄໍາແນະນໍາຂອງຊຸດສະກັດ RNA ການຄ້າ.ທັງທາງລົບ ແລະທາງລົບ
ການຄວບຄຸມໃນຊຸດນີ້ໄດ້ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການສະກັດເອົາ.
2 ການກະກຽມ reagent PCR (ພື້ນທີ່ກະກຽມ reagent)
2.1 ເອົາອົງປະກອບທັງຫມົດອອກຈາກຊຸດແລະ thaw ແລະປະສົມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.Centrifuge ຢູ່ 8,000 rpm ສໍາລັບສອງສາມວິນາທີກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້;ຄິດໄລ່ຈໍານວນທີ່ຕ້ອງການຂອງ reagents, ແລະລະບົບຕິກິຣິຍາແມ່ນໄດ້ກະກຽມດັ່ງທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນຕາຕະລາງຕໍ່ໄປນີ້:
| ອົງປະກອບ | N serving (ລະບົບ 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × ນ |
| ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ RT-PCR | 2 µl × ນ |
| *N = ຈໍານວນຕົວຢ່າງທີ່ທົດສອບ + 1 (ການຄວບຄຸມທາງລົບ) + 1 (nCOVການຄວບຄຸມທາງບວກ) | |
2.2 ຫຼັງຈາກປະສົມອົງປະກອບຢ່າງລະອຽດ, centrifuge ເປັນເວລາສັ້ນໆເພື່ອໃຫ້ຂອງແຫຼວທັງຫມົດທີ່ຢູ່ໃນຝາທໍ່ຕົກລົງໄປລຸ່ມຂອງທໍ່, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ aliquot ລະບົບການຂະຫຍາຍ 20 µl ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ PCR.
3 ການເກັບຕົວຢ່າງ (ພື້ນທີ່ກະກຽມຕົວຢ່າງ)
ຕື່ມ 5μl ຂອງການຄວບຄຸມທາງລົບແລະໃນທາງບວກຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ.RNA ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ຈະທົດສອບແມ່ນເພີ່ມໃສ່ທໍ່ປະຕິກິລິຍາ PCR.
ບີບທໍ່ໃຫ້ແຫນ້ນ ແລະ centrifuge ຢູ່ 8,000 rpm ສໍາລັບສອງສາມວິນາທີກ່ອນທີ່ຈະໂອນມັນໄປຫາພື້ນທີ່ກວດຫາການຂະຫຍາຍ.
4 ການຂະຫຍາຍ PCR (ພື້ນທີ່ກວດຫາການຂະຫຍາຍ)
4.1 ວາງທໍ່ປະຕິກິລິຍາຢູ່ໃນຫ້ອງຕົວຢ່າງຂອງເຄື່ອງມື, ແລະກໍານົດພາລາມິເຕີດັ່ງນີ້:
| ເວທີ | ຮອບວຽນ ເລກ | ອຸນຫະພູມ(°C) | ເວລາ | ການເກັບກໍາເວັບໄຊ |
| ປີ້ນກັບກັນການຖອດຂໍ້ຄວາມ | 1 | 42 | 10 ນາທີ | - |
| ກ່ອນ denaturationn | 1 | 95 | 1 ນທ | - |
| ຮອບວຽນ | 45 | 95 | 15ວິ | - |
| 60 | 30s | ການເກັບກໍາຂໍ້ມູນ |
ການເລືອກຊ່ອງທາງການຊອກຄົ້ນຫາເຄື່ອງມື: ເລືອກຊ່ອງ FAM, HEX, CY5 ສໍາລັບສັນຍານ fluorescence.ສໍາລັບການອ້າງອີງ fluorescent NONE, ກະລຸນາຢ່າເລືອກ ROX.
5 ການວິເຄາະຜົນໄດ້ຮັບ (ກະລຸນາເບິ່ງຄໍາແນະນໍາການທົດລອງຂອງແຕ່ລະເຄື່ອງມືສໍາລັບການຕັ້ງ)
ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາ, ບັນທຶກຜົນໄດ້ຮັບ.ຫຼັງຈາກການວິເຄາະ, ປັບຄ່າເລີ່ມຕົ້ນ, ມູນຄ່າສິ້ນສຸດແລະຄ່າໃກ້ຊິດຂອງເສັ້ນພື້ນຖານຕາມຮູບພາບ (ຜູ້ໃຊ້ສາມາດປັບຕາມສະພາບການຕົວຈິງ, ຄ່າເລີ່ມຕົ້ນສາມາດກໍານົດເປັນ 3 ~ 15, ຄ່າສິ້ນສຸດສາມາດຕັ້ງເປັນ 5 ~ 20, ການປັບຕົວ) ໃນກາຟ logarithmic ຢູ່ໃນຂອບເຂດຂອງປ່ອງຢ້ຽມ, ເສັ້ນໃກ້ຈະເຂົ້າສູ່ໄລຍະ logarithmic, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງຂອງ amplification ຂອງການຄວບຄຸມທາງລົບແມ່ນເສັ້ນຊື່ຫຼືຕ່ໍາກວ່າເສັ້ນຂອບ).
6 ການຄວບຄຸມ Quauty (ການຄວບຄຸມຂັ້ນຕອນແມ່ນລວມຢູ່ໃນການທົດສອບ) ການຄວບຄຸມທາງລົບ: ບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນສໍາລັບຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM, HEX, CY5
COV ການຄວບຄຸມໃນທາງບວກ: ເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນຂອງຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM ແລະ HEX, Ct value≤32, ແຕ່ບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຂອງຊ່ອງ CY5;
ຄວາມຕ້ອງການຂ້າງເທິງນີ້ຕ້ອງໄດ້ຮັບການຕອບສະຫນອງພ້ອມໆກັນໃນການທົດລອງດຽວກັນ;ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ, ການທົດລອງບໍ່ຖືກຕ້ອງແລະຈໍາເປັນຕ້ອງເຮັດຊ້ໍາອີກ.
7 ການກໍານົດຜົນໄດ້ຮັບ.
7.1 ຖ້າບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ ຫຼືຄ່າ Ct> 40 ໃນຊ່ອງ FAM ແລະ HEX ຂອງຕົວຢ່າງການທົດສອບ, ແລະມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຢູ່ໃນຊ່ອງ CY5, ມັນສາມາດຕັດສິນໄດ້ວ່າບໍ່ມີ 2019 ໂຣກ coronavirus ໃຫມ່ (2019-nCoV) RNA ໃນຕົວຢ່າງ;
.2 ຖ້າຕົວຢ່າງການທົດສອບມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນຢູ່ໃນຊ່ອງ FAM ແລະ HEX, ແລະຄ່າ Ct ແມ່ນ ≤40, ມັນສາມາດຕັດສິນໄດ້ວ່າຕົວຢ່າງແມ່ນເປັນບວກສໍາລັບ 2019 ໂຣກ coronavirus ໃຫມ່ (2019-nCoV).
7.3 ຖ້າຕົວຢ່າງການທົດສອບມີເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຊັດເຈນພຽງແຕ່ຢູ່ໃນຊ່ອງທາງຫນຶ່ງຂອງ FAM ຫຼື HEX, ແລະຄ່າ Ct ແມ່ນ ≤40, ແລະບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍຢູ່ໃນຊ່ອງທາງອື່ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບໃຫມ່.ຖ້າຜົນໄດ້ຮັບຂອງການທົດສອບຄືນໃຫມ່ແມ່ນສອດຄ່ອງ, ຕົວຢ່າງສາມາດຖືກຕັດສິນວ່າເປັນບວກສໍາລັບໃຫມ່
ໂຄໂຣນາໄວຣັສ 2019 (2019-nCoV).ຖ້າຜົນກວດຄືນແມ່ນເປັນລົບ, ມັນສາມາດຖືກຕັດສິນໄດ້ວ່າຕົວຢ່າງແມ່ນເປັນລົບຕໍ່ໂຣກ coronavirus ໃໝ່ 2019 (2019-nCoV).
ມູນຄ່າການຕັດສິນໃນທາງບວກ
ວິທີການເສັ້ນໂຄ້ງ ROC ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຄ່າ CT ອ້າງອິງຂອງຊຸດແລະມູນຄ່າການອ້າງອີງການຄວບຄຸມພາຍໃນແມ່ນ 40.
ການຕີລາຄາຜົນການທົດສອບ
1.ແຕ່ລະການທົດລອງຄວນຈະໄດ້ຮັບການທົດສອບສໍາລັບການຄວບຄຸມທາງລົບແລະໃນທາງບວກ.ຜົນການທົດສອບສາມາດຖືກກໍານົດພຽງແຕ່ເມື່ອການຄວບຄຸມຕອບສະຫນອງຄວາມຕ້ອງການການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
2. ເມື່ອຊ່ອງທາງການກວດພົບ FAM ແລະ HEX ເປັນບວກ, ຜົນໄດ້ຮັບຈາກຊ່ອງທາງ CY5 (ຊ່ອງທາງການຄວບຄຸມພາຍໃນ) ອາດຈະເປັນທາງລົບຍ້ອນການແຂ່ງຂັນຂອງລະບົບ.
3. ເມື່ອຜົນຂອງການຄວບຄຸມພາຍໃນແມ່ນເປັນລົບ, ຖ້າຊ່ອງທາງການກວດຫາ FAM ແລະ HEX ຂອງທໍ່ທົດສອບແມ່ນເປັນລົບ, , ມັນຫມາຍຄວາມວ່າລະບົບຖືກປິດໃຊ້ງານຫຼືການເຮັດວຽກຜິດພາດ, t ການທົດສອບບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ດັ່ງນັ້ນ, ຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບໃຫມ່.
